セルロース分解微生物コンソーシアム KKU の分類学的および酵素的基礎

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2968 (2023) この記事を引用

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リグノセルロース系バイオマスは、バイオガス生産の有望な基質です。ただし、その構造が難解であるため、変換効率が制限されます。この研究は、セルロース分解酵素を生産し、リグノセルロース分解の分類学的および遺伝的側面を調査できる微生物コンソーシアム (MC) を設計することを目的としています。既知の KKU-MC1 については、さまざまな生息地からの多様なリグノセルロース分解性細菌と分解酵素が濃縮されました。 KKU-MC1 は、バクテロイデス属 (51%)、プロテオバクテリア (29%)、ファーミクテス属 (10%)、およびその他の門 (8% 不明、0.4% 未分類、0.6% 古細菌、残り 1% その他) に豊富に存在することが判明しました。細菌の優勢性は低い）。炭水化物活性酵素（CAZyme）の注釈により、バクテロイデス属、ルミニクロストリジウム属、エンテロコッカス属、パラバクテロイデス属が多様なセルロースおよびヘミセルロース分解酵素をコードしていることが明らかになりました。さらに、リグニンの分解に関連する遺伝子ファミリーはシュードモナス属でより豊富でした。続いて、さまざまなバイオマスからのメタン生成に対する MC の影響が、バイオオーグメンテーションと事前加水分解という 2 つの方法で研究されました。 KKU-MC1 を 5 日間使用した前加水分解キャッサババガス (CB)、ネピアグラス (NG)、およびサトウキビバガス (SB) のメタン収量 (MY) は、前加水分解していない基質と比較して 38 ～ 56% 向上しました。 15 日間予備加水分解したフィルターケーキ (FC) は、生の FC と比較して 56% 改善されました。 KKU-MC1 増強を行った CB、NG、および SB (初期揮発性固体濃度 (IVC) 4%) の MY は、非増強治療と比較して 29 ～ 42% 改善しました。 FC (1% IVC) は非増強治療よりも 17% 高い MY を示しました。これらの発見は、KKU-MC1 がさまざまなリグノセルロース系バイオマスを分解できるセルロース分解酵素を放出し、その結果バイオガス生産が増加することを実証しました。

嫌気性消化（AD）による有機廃棄物からのバイオガス生産は、近年世界的な関心を集めています。この技術は、増大するエネルギー需要に応え、環境汚染問題に取り組むことができるでしょう1。バイオガス発酵に使用される原料は豊富です。サトウキビバガス (SB) や製糖産業からのフィルターケーキ (FC) などのリグノセルロース系バイオマス、ネピアグラス (NG)、キャッサババガス (CB)、およびある種の産業廃棄物が最も一般的であり、容易に入手できます。しかし、ヘミセルロースネットワークに結合しリグニンによって保護されたセルロースマイクロファイバーで構成される植物細胞壁の非常に難解な性質のため、このリグノセルロース系バイオマスを生物変換に利用することは困難です。さらに、リグノセルロース系バイオマスの加水分解速度が遅いため、分解プロセスが遅くなり、メタン生産効率が低下します。リグノセルロース系バイオマスからのバイオガス生成を増やすには、さらなる処理の前に前処理方法が必要です2。使用される前処理方法は、物理的、化学的、生物学的方法に分類できます3。物理的および化学的前処理により、リグノセルロースの構造が非常に短時間で破壊され、生分解性が高まります。ただし、これらの方法はプロセスコストを増加させ、環境中に有毒な化合物または阻害剤を生成します4。また、前処理後に中和するために酸やアルカリ処理が必要となり、工程が煩雑となる。

酵素または微生物を使用してバイオガス生産用のリグノセルロースバイオマスを調製する生物学的前処理は、物理的および化学的前処理と比較して時間がかかる場合があります。ただし、これらの技術は環境に優しく、費用対効果が高いため、有望です4。ただし、安定または持続的な酵素活性を維持するには、基質の種類、前処理時間、pH、温度などのさまざまな要因を注意深く制御する必要があります。 Parawira 氏によれば、遊離酵素の使用は、安定かつ持続的なリグノセルロース分解化合物を生成する微生物の培養よりも効率的かつ効果的ではない可能性があります 5。一方、リグノセルロースは複雑な性質を持っているため、複数の単離された微生物の混合物を使用する方が、単一菌株を使用するよりも効果的です6。微生物コンソーシアム (MC) は、森林堆肥土壌 7、堆肥生息地 8、SB 堆肥 9、AD10 に基づく堆肥化など、さまざまな生態学的ニッチから分離できます。いくつかの研究では、MC を使用してリグノセルロース系バイオマスの生分解を改善し、バイオガス生産を増加させることに成功しています。たとえば、Wongwilaiwalin et al. MC (分解バガス堆肥から採取した種培養物から作成) で 7 日間処理した NG は、未処理の NG11 と比較してメタン収量 (MY) が 37% 増加することを発見しました。さらに、堆肥、植物の敷料、動物および農業廃棄物から濃縮された MC は、NG12 からのメタン生成を強化しました。

0.05) is shown in Supplementary Table S1. The quadratic and cubic model was chosen as the most effective one for explaining the experimental data (Table S1). The quadratic and cubic model obtained from the mixture design with D-optimal and the analysis of variance (ANOVA) for this model is presented in Supplementary Table S2. To validate the model, an increase in the proportions of SGS resulted in increased FPase activity, while TI does not affect the FPase activity (supplementary Fig.S1a). The avicelase and CMCase may be changes in activities when adjusted the proportion of SGS, which amount should be in the range of 2.0–2.5 mL (supplementary Fig. S1b,c). Additionally, xylanase activity and VS removal efficiency has been strongly affected by the amount of TI, with these values rising as the fraction of SGS increases (supplementary Fig. S1d, S1e). In the meantime, the combination of RSG and SGS is unrelated to improving xylanase activity and VS removal efficiency. From the validation of the model, the combination of RSG, SGS, and TI at optimal proportions 1:1:1 was conducted. The calculation of the combination effect from the response of the mixture design is shown in Table 3. In the case of FPase, the combination effect of Runs 1–16 was in the ranges of 0.22 to 2.03. The combination effect greater than 1 indicates that using a combination of RSC, SGS, and TI at a 1:1:1 ratio (Run 11) is a good way to increase FPase activity. In addition, Run 5 showed a relatively high combination effect (1.98). However, the antagonistic effect of 0.22 on FPase was observed in the proportion of RSC and TI at a 1:1 ratio (Run 6). The synergistic effect on CMCase and avicelase activity was observed in all Runs, especially in Runs 4, 10, and 11. However, Runs 6, 8 (CMCase activity), and 8 (avicelase activity) had a combined effect of 0.9–1.0, approximately the same proportion with neither antagonistic nor synergistic effect. Antagonistic effect on xylanase activity, a combination effect of 0.10–0.12 was obtained from the combination in Run 5 and 7. Meanwhile, a synergistic effect on xylanase activity, a combination effect of 3.13, was found at the optimal proportions of microorganism source, i.e., at a 1:1:1 ratio of combination as RSC, SGS, and TI (Run 11). A synergistic effect on VS removal efficiency was also found in Run 11, with a combined effect of 2.43. The results showed that the combined MC of Run 6 antagonizes all enzymes involved in lignocellulose degradation. In contrast, the combination of MC from Run 11 showed a synergistic effect on enzymes involved in lignocellulose degradation and the efficiency of VS removal. Lin et al. stated that sharing and exchanging public goods such as carbohydrates and aromatic monomers is the essence of cellulolytic microbial synergistic interactions25. In our case, the MC1 showed mutualism (+/+), one of the synergistic interactions caused by sharing public goods26,27./p>

SB > NG > FC, depending on the lignocellulosic content of each substrate. The CB has a lower lignin content (12.61 ± 5.6%) than the NG, and SB (see Table 1), so lignin and hemicellulose are readily degraded, and microbes use cellulose more easily. Meanwhile, the lowest MPR of FC could be due to an imbalance of the carbon-to-nitrogen (C:N) ratio in the AD process. The FC had a relatively low C:N ratio (24:1), around the lowest recommended limit63. Thus, a co-digestion strategy was introduced to balance C:N nutrients to improve this substrate's degradability and energy production./p> 10%, reads containing adaptor sequences, and reads where 40% of the bases had a Q score of 38). Clean reads were assembled using SOAPdenovo83, and reads with the default parameters (k-mer size of 55 and scaftigs less than 500 bp) were kept for further analysis. Genes were predicted using MetaGeneMark from the scaftigs. After dereplication, all unique genes were used to construct the gene catalogue. BLAST was performed against the MicroNR database to generate taxonomy annotation information for the gene catalog. The top 10 taxa, including phylum, class, order, family, and genus, were visually shown using Krona84. The functional annotation databases were used: the KEGG85,86,87, eggNOG (Version: 4.1)88, and CAZymes (Version: 2014.11.25)89. To represent the number of genes coding for lignocellulose degrading enzymes with the most abundant genus found in the KKU-MC1 metagenome. We have used Microsoft Excel 365 to visualize heat maps and Microsoft PowerPoint 365 to visualize pathways./p>