薄層クロマトグラフィー (f) を使用したマイコラクトン A/B の検出における代替ボロン酸

BMC 感染症第 23 巻、記事番号: 495 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

マイコバクテリウム・ウルセランスは、ブルーリ潰瘍の原因物質です。 M. ulcerans 病の病理は、この病気の毒性において重要な役割を果たす、マイコラクトンとして知られる強力なマクロライド細胞毒素の分泌に起因すると考えられています。 マイコラクトンは、蛍光薄層クロマトグラフィー (f-TLC) 技術を使用して検出できる、BU 診断用のバイオマーカーです。 この技術は、蛍光発生化学センサーとして機能する 2-ナフチルボロン酸 (BA) によるマイコラクトン A/B の化学的誘導体化に依存しています。 しかし、同時抽出されたヒト組織脂質によるバックグラウンド干渉、特に臨床サンプルの場合、メソッドの主観性と相まって、BA に代わる方法を見つけるための研究が必要です。

26 種類の市販のアリールボロン酸が、f-TLC 実験を使用して BA の代替品として最初にスクリーニングされました。 また、マイコラクトン A/B およびミコボロン酸付加物の吸収極大スペクトルを決定するために UV-vis 測定も実施され、その後、マイコラクトン A/B と当社の 3 つの最も有望なボロン酸との間のボロン酸エステル形成の蛍光増強能力が調査されました。酸 (BA15、BA18、BA21)。 LC-MS 技術を使用して、ミコラクトンとボロン酸の間の付加物の形成を確認しました。 さらに、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) で確認された BU 患者サンプル 6 件を使用して、BA18 と BA の間で比較研究が実施されました。

ボロン酸のうち 3 つ (BA15、BA18、および BA21) は、BA よりも優れた蛍光バンド強度を生成しました。 3 つのボロン酸の 0.1 M 溶液と、10 ng ～ 90 ng に相当する 1 μL ～ 9 μL の範囲のさまざまな容量の 10 ng/μL の合成マイコラクトンを使用して、薄層クロマトグラフィー (TLC) で複合体形成研究を行ったところ、myco- BA18 付加物は、目に見えて最も強い蛍光バンドを伴って出現します。 遊離マイコラクトン A/B の紫外可視吸収極大 (λmax) は 362 nm で観察され、付加物 myco-BA15、myco-BA18、および myco-BA21 の値は 272 nm、270 nm、および 286 nm で観察されました。それぞれ。 マイコラクトン A/B の実験値 362 nm と、マイコラクトン A/B の脂肪酸側鎖のウッドワード フィーザー計算値 367 nm の比較は、2 つの環状ボロネートが形成されたにもかかわらず、南側のボロネートのみが形成されたことを示しています。発色団を有する鎖は、365 nm の照射によって励起されました。 蛍光実験では、BA18 を 1,3-ジオールを介してミコラクトン A/B に結合させると、537 nm での蛍光強度が著しく増強されることが実証されました。 高分解能質量分析計 (HR-MS) を使用して、myco-BA15 付加物の形成を確認しました。 最後に、BA18 を含む患者サンプルの f-TLC 分析により、元の BA 付加物と比較して BA18 付加物の強度が向上しました。

BU の診断のための f-TLC 分析で使用される BA の代替品として、26 種類の市販のボロン酸が調査されました。 そのうちの 3 つ (BA15、BA18、BA21) は優れた蛍光バンド強度プロファイルを示しました。 彼らは、マイコボロン酸付加体形成後および BA18 患者からの臨床サンプルを用いた実験で最も解釈しやすいプロファイルを提供しました。 したがって、BA18 は BA の潜在的な代替品として特定されており、現在 BA の使用に関連している臨床サンプルから共抽出されたヒト組織脂質のバックグラウンド干渉という課題に対する解決策を提供できる可能性があります。

査読レポート

マイコラクトン (ML) は、ヒト病原体マイコバクテリウム・ウルセランス (MU) によって産生されることが知られている最初のマクロライド系細胞毒素であり、ブルリ潰瘍 (BU) の原因物質です [1、2]。 これは、マイコバクテリウム属で確認されている唯一のマクロライドです [3]。 1965 年、Connor らは、M. ulcerans が拡散性細胞毒素の生成に関与しているという仮説を立て、その後モルモットを用いてそのことが確認されました。 マイコバクテリアの培養濾液を実験動物に注射すると、ヒトの感染症と同様の壊死が引き起こされました[4、5、6]。 その後、疑わしい分子は、1999 年に George らによって M. ulcerans の脂質抽出物のアセトン可溶部分から効果的に単離、精製され、特徴付けされました。 その後、化学構造はマイコラクトン (ML) と名付けられたポリケチドとして解明されました [7、8]。 ML は、薄層クロマトグラフィー (TLC) 上で、クロロホルム/メタノール/水 (90:10:1、vol/vol/vol) 中で保持係数値 0.23 の淡黄色の紫外線活性脂質バンドとして検出されました [7]。 マイコラクトンのナトリウム付加物に対応する m/z 765 の顕著なピークが、エレクトロスプレー条件下での質量分析 (MS) 分析によって観察されました。 ML は、その中心に 12 員ラクトン環を持ち、南側に C1' ～ C16' の番号が付いた C5-O-結合多価不飽和アシル側鎖と、炭素原子 C12 ～ C20。 マイコラクトンの異なる同属体は「サザン」鎖の違いから生じますが、上部の「ノーザン」鎖は不変です。 さらなる研究により、M. ulcerans から得られたミコラクトンは、ミコラクトン A および B として知られる 2 つの立体異性体の 3:2 の組み合わせであることが明らかになりました。これらは、C4' C5' の二重結合の周囲で自然発生的な幾何異性体として形成されます (間の波線で示されています)。 C5' および C6') [9, 10] (図 1)。